小分子药物的新时代？—“独步江湖”的化学蛋白组学（上）
撰文 | Anosniff
2017年4月6日
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引言
近些年来，生物医药领域的投资如火如荼，然而，大部分人只对某个靶点的某个临床前药物感兴趣，而对于新药发现的源头创新技术知之甚少，没有充分认识到该领域存在的潜在投资与研发机遇。因此，这个系列文章旨在总结介绍这一领域中化学蛋白组学（Chemoproteomics）的最新进展。
进入正题之前，先响应一下去年年底雨里和modestxie两位关注的话题（雨里：《小分子药物发现的新技术和新思维》和modestxie的《小分子，大作为—小分子创新药物发现之随想》）。先看图一，人体药物靶点开发的现状图（FDA药物靶点数据出处为的统计页面，2016年底数据，其它的预测靶点数据是基于多篇文献的折中估值）。如图所示，生物大分子的靶点开发率还不到预测的10%，所以目前如火如荼的生物大分子药物开发盛况也就不难理解了。小分子药物的开发价值和潜力也不容小觑，目前仍有超过30％（～800个，注意，这些只是传统认为“可成药”的受体和酶的数量）的潜在靶点没有对应的小分子药物，不仅如此，“大分子药物是小分子药物的开路先锋。对于全新靶点，如PD-1，PCSK9，先看抗体等大分子能否成药，如能成药，通过努力一定能找到相应的小分子药物”（摘自蒋华良老师对雨里近期文章的评论第二点）。我们不妨作个乐观假设，如果两类药物的总靶点数（～4500个）都存在理论上的靶向小分子药物，那么小分子药物研发者们将拥有非常广阔的空间，用于施展自己的才华！
图一：人体药物靶点开采现状
正文
化学蛋白组学“独步江湖”
背景
令人担忧的是，与大分子抗体药物研发相比（兔子），小分子药物发现虽然起步早，但是开发难度越来越大（乌龟）。因为这是一场没有终点的赛跑，如果我们沿用传统的技术和思路，那么无论我们多努力地紧赶慢跑，兔子赶上乌龟只是时间问题。小分子药物的发现，尤其是活性分子和先导药物的前期发现，亟需“新技术和新思维”。我们先来看一下药物分子发现的传统技术及其特点（图二），传统技术主要有三种：1）天然产物筛选，2）小分子库海量筛选，3）合理化药物设计。由于它们固有的发现耗时漫长，靶点选择性／毒性难以预测，化学改进困难和针对靶点少等缺点，导致现在小分子药物开发难度逐年增加，具体表现在a)全球在研小分子药物数量增长的难可持续性和b)研发后期品种高流失率。这也许正是近期大家对小分子药物研发前景的忧虑和进行重新思考的根本原因。
图二：药物分子发现的传统渠道及其局限性
说到药物发现，尤其是药物的早期发现，我们就不得不提化学生物学。尤其是蛋白质组学的策略，是高效且强大的临床前药物研发方法，可以用于发现和鉴定新型药物和靶标。新型化学工具，生物正交化学技术，疾病相关表型系统，化学信息学和化学蛋白组学的发展和组合为搞清“药物-靶-表型”关系提供了强大和高通量的研发流程。
化学生物学的发展给药物的早期发现，特别是蛋白靶点的鉴定和分子药理学的确认，提供了众多的关键技术（有兴趣了解其他技术的读者可以参考上海药物所王明伟教授的一篇简要综述）(Zhu et al., Archives of pharmacal research, 2015)。本篇主要关注化学生物学的一个分支，化学蛋白组学，点评一下相关前沿技术在活性分子和先导药物发现中潜在价值。(Nguyen et al., Methods in molecular biology, 2017)（以后可能陆续探讨化学生物学的其它技术在药物发现中应用。）
与传统药物发现思路的“万箭连发”地“死磕”一个靶点相比，基于化学蛋白组学的早期药物发现思路是“万靶俱备，只欠好箭”（图三）。“好箭”指的就是结构新颖，对靶点的潜在选择性好的化学分子，而“万靶”就是细胞或组织里的蛋白集合，即蛋白组学。通过设计和制备结构多样化的各种“分子箭”，然后运用各种现代分析技术考察“分子箭”同时面对众多靶点时的亲和性和选择性，从而找出最佳的药-靶关系，即活性分子／先导药物和相应的靶点的各种信息。可以说，基于化学蛋白组学的药物发现是集“精湛的分子设计和合成”与“高超的分子分析”于一身的一门艺术，因此我选择这一主题作为对医药研发社交平台（现在叫“药时代”）的第一篇供稿。
图三：药物发现的传统技术与基于化学蛋白组学新技术的效率比较示意图
蛋白组学的发展初期，主要依靠2D蛋白胶＋Edman降解或短肽质谱鉴定蛋白，近十几年来，快速发展的质谱技术配合强大的SEQUEST算法，使得蛋白组学能够实现全局蛋白的快速鉴定和定量分析。这一技术进展缘于人们渴望获得病变前后蛋白表达水平变化模式，有了这些信息，就可以去解释病因了，遗憾的是，这一尝试并没有像预期的效果好。“无心插柳柳成荫”。有趣的是，与有机合成化学结合的蛋白组学，诞生了化学蛋白组学，因为它擅长于分析活性分子或者药物分子作用前后靶点蛋白的信息变化，开始在新药发现中展示出“独步江湖”的魅力。
也许药物合成化学家们都有一个梦想，那就是，可以快速地获取自己合成的分子跟细胞内所有靶点蛋白结合强弱的全部信息。但是现实很残酷，目前只有约100～300万个分子被人为地放入各种分子库，从而有幸被某些单一靶点“翻牌”，步入高通量筛选的“寝宫”。而大多数人类创造出来的分子只是孤独地躲在某个无人注意的角落，暗自神伤，终身无法被某个靶点“亲睐”，更不用提它们可以有机会去“阅人无数”，跟细胞内所有靶点蛋白来一次“集体相亲”。
这样残酷现实的原因，是人类还没有开发出灵敏和准确的通用方法，去普查药物分子和所以蛋白的结合关系。令人欣慰的是，近些年来药物发现的江湖上冒出了一个小哥——人称“化学蛋白组学”，骨骼清奇，他有着父亲高贵的血统（蛋白组学），只不过跟着母亲（有机化学），出身卑微，机缘巧合中，他习得了四大绝技，使它迅速在江湖新秀中脱颖而出，开始了“独步江湖”的历程。他的出现，为无数苦闷的化学分子寻找心仪的靶点蛋白，带来了一点希望。
I 龙爪手——共价键擒靶法
化学蛋白组学小哥的第一个绝技，少林龙爪手，属于擒拿绝技之一，是武侠小说里有名的武功之一，用于近身擒拿或者制服对手。那么他的龙爪手是怎么擒拿目标靶点的呢？受到共价键药物的启发（图四），最初的化学蛋白组学通过共价键擒靶法，利用已知小分子或分子片段，跟细胞或者细胞裂解液里的成千上万的蛋白作用。因为这些小分子装配着一个亲电基团，它们可以与含有高活性亲核基团（丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸残基）的蛋白质形成共价缀合物，于是靶点就被小分子通过共价键牢牢的“抓住”了。因为共价键牢固，分子／蛋白缀合物可以任你“煎炸蒸煮”而不分开，极大地帮助了靶点鉴定。
举个例子，利用广谱的亲电试剂α碘代酰胺，可以一次抓到890个含有半胱氨酸的蛋白。(Weerapana et al., Nature, 2010)
图四：共价键药物发展历史（来自wiki）
但是“龙抓手”的修炼可不容易，如图五所示，小分子（跟蛋白结合的骨架部分，图五c）需要进行化学改造，加上化学活性官能团如Michael受体，环氧基团，酸酐和酰基卤化物（图五a），或者光激发偶联基团（图五b），以及报告基团如生物素（用于富集）和荧光素（用于显色）（图五d）。为了减小探针尺寸，也可以先用炔基和叠氮替代报告基团（图五e），在生物样品处理后期通过click chemistry加上报告基团(Niphakis and Cravatt, Annual review of biochemistr 47 32201 47 15289 0 0 1895 0 0:00:16 0:00:08 0:00:08 2963 47 32201 47 15289 0 0 1649 0 0:00:19 0:00:09 0:00:10 3221y, 2014)。“龙抓手”的一个明显缺陷是，一个分子本来可以结合某些蛋白，但是因为它被改造了，结果很可能不再跟原来的蛋白结合了。 换句话说，分子已经不是原来的分子了。因此，这一方法的最大的瓶颈是探针分子的设计和合成。令人鼓舞的是，近年来C－H直接官能团化的快速进展为解决这一难题带来了可能。(Dai et al., J Am Chem Soc, 2011)
图五：用于“龙抓手”的三官能团探针模块，来自(Niphakis and Cravatt, Annual review of biochemistry, 2014)
经历了第一步分子设计和第二步分子合成，得到的三官能团分子（结合，反应活性和报告三个基团），第三步便是让它们跟细胞或者活体动物作用并进行样品前处理和收集，第四步是仪器测试进行数据收集并分析出可能靶点，最后一步是靶点验证。
“举个例子，利用带有炔基的beta内酰胺探针分子，寻找到了蛋白水解酶ClpP的选择性抑制剂。（图六）(Bottcher and Sieber, Angewandte Chemie, 2008)”
图六：用beta内酰胺探针分子寻找蛋白水解酶ClpP的选择性抑制剂，来自(Bottcher and Sieber, Angewandte Chemie，2008)
近一两年来，这一领域出现了一系列重大突破，发表了几篇CNS级的工作：如利用高度疏水的分子探针专门抓膜蛋白靶点，发现了与分子探针结合的280个drugbank收录的膜蛋白和高达840个非drugbank膜蛋白(Niphakis et al., Cell, 2015)。 另一个工作是利用跟半胱氨酸特异反应的片段探针库，抓到637个靶点蛋白，其中92个在drugbank里面，而高达545个蛋白还没有被drugbank收录(Backus et al., Nature，2016)。最后一个工作更牛，是利用含有光激发偶联基团的片段探针库，收集到了几万组小分子和靶点蛋白的相互作用信息(Parker et al.，Cell，2017)。
下篇预告：
“II 吸星大法——激酶珠球筛选法
III 金钟罩——蛋白稳定性寻靶法
IV 引天雷——诱导灭靶法
V 展望”
作者简介
倪锋 厦门大学化学系学士，有机化学博士。南加州大学化学系博士后，高级研究员，高级科学家研究员
。先后十余年一直从事功能探针和药物探针分子设计，并应用于生物固氮酶，蛋白激酶和GPCR蛋白的研究。
现担任洛杉矶TarGead Sciences CEO，利用高通量先导药物和靶蛋白发现技术平台，进行先导药物/靶点发现并转让授权，同时向医药研发同行提供先导药物/靶点验证服务与靶点发现合作。
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参考文献：
Backus,K.M., Correia, B.E., Lum, K.M., Forli, S., Horning, B.D., Gonzalez-Paez, G.E.,Chatterjee, S., Lanning, B.R., Teijaro, J.R., Olson, A.J., et al. (2016). Proteome-wide covalent ligand discovery in native biological systems. Nature 534, 570-574.
Bottcher, T., and Sieber, S.A. (2008). Beta-lactonesas privileged structures for the active-site labeling of versatile bacterial enzyme classes. Angewandte Chemie 47,4600-4603.
Dai, H.X., Stepan, A.F., Plummer, M.S., Zhang, Y.H.,and Yu, J.Q. (2011). Divergent C-H Functionalizations Directed by Sulfonamide Pharmacophores: Late-Stage Diversification as a Tool for Drug Discovery. J Am Chem Soc 133, 7222-7228.
Nguyen, C., West, G.M., and Geoghegan, K.F. (2017).Emerging Methods in Chemoproteomics with Relevance to Drug Discovery. Methods in molecular biology 1513, 11-22.
Niphakis, M.J., and Cravatt, B.F. (2014). Enzyme inhibitor discovery by activity-based protein profiling. Annual review of biochemistry 83, 341-377.
Niphakis, M.J., Lum, K.M., Cognetta, A.B., 3rd, Correia, B.E., Ichu, T.A., Olucha, J., Brown, S.J., Kundu, S., Piscitelli, F.,Rosen, H., et al. (2015). A Global Map of Lipid-Binding Proteins and Their Ligandability in Cells. Cell 161,1668-1680.
Parker, C.G., Galmozzi, A., Wang, Y., Correia, B.E.,Sasaki, K., Joslyn, C.M., Kim, A.S., Cavallaro, C.L., Lawrence, R.M., Johnson,S.R., et al. (2017). Ligand and Target Discovery by Fragment-Based Screening in Human Cells. Cell 168, 527-541 e529.
Weerapana, E., Wang, C., Simon, G.M., Richter, F.,Khare, S., Dillon, M.B., Bachovchin, D.A., Mowen, K., Baker, D., and Cravatt,B.F. (2010). Quantitative reactivity profiling predicts functional cysteines in proteomes. Nature 468, 790-795.
Zhu, Y., Xiao, T., Lei, S., Zhou, F., and Wang, M.W.(2015). Application of chemical biology in target identification and drug discovery. Archives of pharmacal research 38, 1642-1650.
本文独家首发于微信公号《药时代》（原《医药研发社交平台》）。
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作者： Anosniff
出处： 药时代（ID：drugsns）
编辑：Walker 配图：网络
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